La présente Ligne directrice décrit un essai de dépistage in vivo sur des groupes de poissons (composés de mâles sexuellement matures et de femelles reproductrices) exposés à une substance pendant une durée limitée de leur cycle biologique (21 jours). L’essai à court terme de reproduction a été validé chez le tête-de-boule (Pimephales promelas), qui est donc l’espèce de prédilection. L’essai est mené avec trois niveaux de concentration chimique et les contrôles appropriés, y compris un contrôle contenant le solvent si nécessaire. Pour le tête-de-boule, quatre réplicats sont utilisés pour chaque niveau de concentration et contrôle(s).  Pendant toute la durée de l’essai, la fécondité est en outre évaluée quotidiennement sur le plan quantitatif. A l’issue de cette période d’exposition de 21 jours, deux biomarqueurs sont mesurés chez les mâles et les femelles pour servir d’indicateurs des effets de la substance d’essai sur le système endocrinien ; ces biomarqueurs sont la vitellogénine et les caractères sexuels secondaires. Les gonades sont préservées et l’histopathologie gonadique peut être utilisée pour évaluer l’adaptation du système reproducteur des animaux testés et pour confirmer les éléments de preuve apportés par les autres biomarqueurs.