Les poissons sont exposés à la substance d'essai, de préférence pendant une période de 96 heures. Les mortalités sont enregistrées à 24, 48, 72 et 96 heures et les concentrations qui tuent 50% des poissons (CL50) sont déterminées quand cela est possible.

Une ou plusieurs espèces peuvent être employées, le choix étant à la discrétion du laboratoire d'essai. Au moins sept poissons doivent être employés à chaque concentration d'essai et dans les contrôles. La substance d'essai devrait être administrée à cinq concentrations, au moins, appartenant à une série géométrique avec un facteur ne dépassant pas de préférence 2,2. L'essai limite correspond à un niveau de dose de 100 mg/l. Cette étude inclut les observations des poissons au moins après 24, 48, 72 et 96 heures. Le pourcentage de mortalité cumulée, pour chaque période d'exposition, est tracé en fonction de la concentration sur du papier log-probit.